►从滤光片转轮到声光可调滤光器（AOTF）

荧光的激发需要特定颜色的光：既要有效地激发探针（波长接近探针激发光谱的=值），又要留下足够的空间收集发射光而不会进入检测器的光路中。在共聚焦显微镜中，通常使用多种谱线的激光器作为激发光源，这需要设备既能够自由选择适合当前实验所用荧光团的激发谱线又能够控制该激发谱线的强度，因为直接在光源处控制强度时，大多数激光器会出现噪音增强的现象。AOTF（声光可调滤光器）的引入简化了滤光过程，同时显着提高了实验的灵活性。AOTF对于耦合白激光是一个明智选择。

►滤光片转轮-早期的滤光工具

传统激光器通常只发射一条或几条单一波长的激光谱线（新一代的解决方案是白激光）。然而，生物医学成像所使用的荧光染料的激发光谱从覆盖了从近紫外到近红外波长的范围。大多数情况下，为了同时检测几种不同荧光染料的发射情况，需要通过二向色镜结合一系列激光谱线来实现。

由于通常激光器的低频噪声频带相对较窄，因此不建议直接通过调整激光功率控制强度。因此，需要一种设备来单独减弱激光强度。同样，如果关闭和次数过多，激光器寿命也会缩短。特别是气体激光器，在关闭后仍处于高温状态而未冷却时，不适合马上再次开启。

►声光可调滤光器的运行方式

简化机械设置并将灵活性提高几个数量级的一个重要步骤是采用声光可调滤光器（AOTF）。AOTF是一种可以控制所需颜色的光指向一个不同的方向的设备，而其余颜色的光直接通过 AOTF。AOTF由晶体制成，通常是TeO2或SiO2或其他具有类似特性的化合物。晶体由机械转换器在几百兆赫范围内的机械波激发（声光可调滤光器的“声”是指机械波，尽管频率不符合人耳可听见声音的频率）。重要的是所需光束偏转的方向是固定的，不会随光的颜色而改变。此外，指定方向的进光量也可以通过机械波的振幅进行控制。

总而言之，AOTF用机械固定的晶体完全取代了传统的快门、衰减滤片和谱线选择滤片，可以轻松实现任意谱线的组合；比如同时可以提供8条谱线时，组合方式达到256种——这对于AOTF来说都不是问题。另外：每条选定的谱线在强度上都是无级可控的。本质上，AOTF是一个“8通道激光调光器”。

►AOTF额外的好处

图1：用不同激光谱线或不同强度的同一条激光谱线扫描感兴趣的区域。在激光谱线扫描期间，照明方式会根据预定义的模式在预设点发生变化。任何组合都是可能的，几乎所有图形都可以使用鼠标在预扫描的图像上绘制。当然，也可应用几何图案（矩形、圆形、椭圆形……）。“零线”也是一种模式，常用于保护细胞培养物中的背景细胞。

声光分束器可在特定样本中进行任意符合荧光染料组成的激光组合。除此以外，假设用两种不同的荧光染料对标本进行染色，一种非常强，另一种非常弱，而无级调谐通过调暗明亮染料的激发来检测强度相似的两种荧光，可以平衡荧光发射强度。因为AOTF的控制速度很快，不需要停止扫描过程，所以很容易在成像过程中即时实现。

通过无级控制来平衡激发光强度，不仅有利于对比荧光通道，而且还是改善荧光染料光谱拆分的利器。许多染料的发射光谱出现“拖尾”现象，导致在成像的通道收集了错误的信号。通过将激发降至低，可以改善发射光谱的拆分（压制串色）。

选定谱线的波长（和强度）之间的切换在几微秒内完成，速度非常快；相比之下，机械滤光片转轮大约需要一秒钟。这种快速切换使得在单条谱线的扫描期间可以改变激发方式（采用何种波长的谱线，这些谱线分别对应多大强度）。此功能可在样本上绘制用不同激发光激发的区域，即所谓的“感兴趣区域”，在这些区域中，不同的激光被激活用于成像。

此外，无需采集信号的区域不会被照射，非常好地保护了样本以供日后研究。另外，如果选择白光激光器作为光源，AOTF可以选择白激光中任何可用的颜色。在此情况下，声光可调滤光器将白激光变成可调光源。

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