在蔡司“从图像到结果”系列推文中，我们将为您带来不同类型的案例研究，探索如何从您样本的显微图像中以快速有效的方式量化数据结果。

本期案例蔡司君将带您进入细胞生物学领域细胞骨架研究，探讨如何将显微镜中的图像分析工具与高内涵筛选相结合，实现自动化的图像分析功能。

 

实验与方法

 

为研究肌动蛋白细胞骨架的细胞调节机制，本次实验针对RhoGTPases细胞酶家族建立了siRNA文库筛选。

研究人员对U-2OS骨肉瘤细胞系做了四种标记：

✓ Hoechst标记细胞核（cellular nuclei）

✓ phalloidin标记肌动蛋白（actin）

✓ tubulin抗体标记微管（microtubules）

✓ VASP抗体标记黏着斑（focal adhesions）

这类标记方式便于自动化成像及图像分析处理，同时允许研究人员在单细胞层面上测量大量的细胞特征。

实验使用siRNA文库对96孔板细胞样本进行处理，采用蔡司Celldiscoverer 7对96孔板内的细胞进行全自动高分辨率成像，通过arivis Vision4D对siRNA文库筛选的细胞骨架的高内涵特性进行图像分析。

 

图像分析流程

在arivis Vision4D中，针对这类高内涵图像分析的目的是获取尽可能多的相关信息，这就意味着我们将以单细胞为基准测量统计所有样本的特征参数。因此，针对单细胞建立一套自动化且稳健的分析流程尤为重要。完整的图像分析流程如下图所示。

 

▲  arivis Vision4D图像分析流程

 

首先，我们使用区域生长分割法（Region Growing）准确提取出完整单个细胞区域：

 

▲ 细胞体的三步分割过程。A图：基于Hoechst通道提取细胞核。B图：以actin通道为外边界检测细胞区域。C图：基于合并的四通道提取出终的单细胞胞体。

 

其次，使用分水岭分割法(Watershed)依次提取出通道中的肌动蛋白和微管；通过Blob Finder分割工具提取出黏着斑。

为了将这些分割对象准确分配给所属的单个细胞，我们以细胞体为母体，以细胞核、肌动蛋白、微管和黏着斑为子体，生成隔室，从而形成完整的“细胞体”对象。具体提取结果见下图：

 

▲ 图像分割的验证。上图为原始图像通道，下图为分割结果。颜色编码代表所属细胞母体的正确分配。

我们使用arivis Vision4D的对象管理器提取单个细胞层面以及完整样本层面的细胞特征参数，包括细胞体和细胞核的细胞形态特征（面积、强度和圆度），肌动蛋白、微管和黏着斑的各项特征参数（强度、面积和对象编号）。

 

▲ 样本层面及单细胞层面量化的特征参数列表

 

可视化结果呈现

 

＋细胞数量分布

在统计数据时，我们查看了细胞的数量分布，下图展示了从10个到300个细胞的大范围分布，每个样本检测到细胞的中位数是118.5个。这表明siRNA文库处理对细胞的活力影响非常大。

 

▲  每个孔的细胞数分布

 

＋siRNA处理对细胞骨架形成的影响

为了检验siRNA文库处理是否产生了与细胞骨架组成有关的可检测的反应（如下图)，所有编号孔位的细胞在经过siRNA处理后，微管、肌动蛋白和黏着斑的表达，以及细胞胞体大小(细胞骨架变化的结果)都存在相当大的差异。

▲  示例图像显示数据集内定量读出的变化。每张图像均标注了样本ID。A图：细胞胞体尺寸；B图：黏着斑强度（橙色）；C图：肌动蛋白的强度（紫色）；D图：微管强度（绿色）

 

单细胞层面的聚类分析

我们使用Clustergrammer（一种聚类分析工具）对提取的细胞的（或者样本的）全部特征进行分类统计。

首先，我们对获取的特征参数进行归一化处理，并将数据结果绘制成热图（如下图）。A图是按样本顺序展示的每个单细胞的热图。从该特征图可以看出，实验特征在不同样本之间存在较大的差异，但在同一样本内是一致的。

其次，我们根据特征相似性对该数据进行重组，见B图来自不同样本的细胞汇聚成了具有相似表征的群体。

 

▲  单细胞层面的数据集聚类分析。（A） 按样本顺序显示的单细胞热图。 （B） 细胞被重新排序后显示相似反应的集群。红色条表示增加值，蓝色条表示减少值。图中边缘的灰色标记代表集群。附加的一列颜色代码代表样本ID。

从B图所示的集群特征显示看出，我们不仅可以观察到细胞的不同特征组合：例如，一个集群显示存在大量的肌动蛋白和微管，而另一个集群显示存在大量的黏着斑；

还可以看到显示出来的基本特征：例如，当看到细胞核强度与面积的特征集群时，我们可以知道它们受到siRNA处理的影响，而“单个黏着斑强度”和“每个细胞的黏着斑数量”并没有出现在同一个集群中，它们可能不受siRNA处理影响等。其他统计信息在此不做过多阐述。

总而言之，从数据集统计分析结果中我们可以获取非常丰富且具有生物学意义的信息与启示。

 

样本层面的聚类分析

arivis Vision4D同样可以通过对一个样本的所有对象进行分组来生成这种数据矩阵，从而用于对样本层面的特征参数进行统计分析。

对于样本层面的统计结果我们可以用相似图（聚类分析的另一种可视化方法）的方式展现（如下图）。相似图能够直接显示出数据结果的相似度，红色代表高的相似度，蓝色代表低的相似度，当两个轴上的分类相同时，相似度矩阵就是一个交叉矩阵。查看相似图C，我们现在可以直接观察到集群及其相应的样本编号（如下表）。

 

▲  样本层面上数据集聚类分析。B为聚类热图。A和C则是相似图， 它们分别比较的是同类型范畴的高相似（红色）和低相似（蓝色）分布。

 

▲  聚类成组的样本编号。

为了表明自动聚类分析生成了有意义的结果，下图显示了某些集群的原始图像。从这里我们可以看出，多维数据提取和聚类分析非常有效地识别了大范围的细胞表征的相似性和差异性。

 

▲ 部分集群的原始图像。对于每个集群，均显示了不同的区分特征。

 

总结

在本案例中，我们通过使用arivis Vision4D实现对高内涵成像实验进行自动化统计分析，展示了高内涵分析如何成为假设生成和验证的强有力技术手段。

同时，arivis Vision4D支持将此类大批量分析扩展至其他复杂的实验分析流程当中。如在本案例的样本上做更多的标记，获取更多的特征参数，或指定更复杂的特征进一步细化分析等。

另外，arivis Vision4D支持使用更多的数据分析工具，如果将成像结果与其他数据源相联系，实验信息含量将呈指数级增长！

＋用arivis VisionHub实现拓展分析

随着高内涵筛选等复杂高通量的实验需求增多，研究者对数据存储管理及图像自动化分析的需求也越来越高，蔡司君为您提供新一代数据平台管理方案——arivis VisionHub，它可以提供图像管理及批量图像处理分析功能。您可以在arivis Vision4D中建立分析流程，并快速上传至VisionHub进行服务器端批量分析。它将大大减少您的数据分析时间，同时将数据结果与在线合作人员实现共享。

 

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