对小鼠整个视网膜进行快速、清晰的高对比度成像，以研究内皮细胞、血管、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的相互作用。

本文描述通过使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）技术有效地研究小鼠视网膜中内皮细胞、血管、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的相互作用。视网膜血管疾病一般是视力受损的主要原因。基因突变会导致人体视网膜血管发生改变，进而引发家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR）、诺里病、早产儿视网膜病变（ROP）或Coats病。

视网膜中内皮细胞、血管、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的相互作用可使用小鼠视网膜模型来进行研究。通过整个视网膜制样和高分辨率荧光成像可观察视网膜血管网络和细胞相互作用的信息。

简介

视网膜血管疾病是导致视力受损和失明的主因[1]。大多数哺乳动物的视网膜由三层血管网络形成，其中包括两个视网膜内毛细血管床。在人体内，基因突变会引发家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR）、以及周边视网膜血管化不完整为特征的遗传性疾病、如诺里病、早产儿视网膜病变（ROP）或Coats病[1]。患有这些疾病的视网膜血管都有所改变。科学家利用小鼠视网膜模型来研究视网膜中内皮细胞、血管、小胶质细胞和星形胶质细胞间的相互作用。利用整个视网膜制片来展示视网膜血管[1]。固定并染色后，对整个视网膜进行高分辨率成像，以观察整个血管网络及单细胞相互作用。本文将展示如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）有效地研究小鼠视网膜细胞间的相互作用[2，3]。

挑战

如何对整个视网膜进行快速成像，并获得清晰的高对比度3D成像结果，展示重要细节对研究视网膜至关重要。视网膜成像一般使用共聚焦显微镜进行扫描，但是这种方法要花费数小时才能采集到整个视网膜图像。而常规的宽场显微虽然成像速度快，检测灵敏度高，但是对厚标本的成像，如整个视网膜，通常会出现非焦平面干扰导致模糊，降低对比度[2，3]。

方法

使用THUNDER Imager 3D Cell Culture仪器对整个视网膜进行成像。使用抗CD31抗体标记视网膜内皮细胞（黄色），使用IsoB4标记视网膜血管和小胶质细胞（品红色），并使用抗GFAP抗体标记星形胶质细胞（青色）。观察整个视网膜时，采用3个荧光通道，用20x Plan Apo 0.8 NA（数值孔径）物镜和100个视野拼接、厚度为15-μm进行 Z轴堆栈成像。

结果

Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2，3]方法可清晰展示视网膜内的内皮细胞、小胶质细胞和星形细胞间的相互作用（见图1）。一般情况下，通过宽场显微镜很难观察到视网膜中的这些细胞。通过THUNDER Imager 3D Cell Culture进行高速采集，可在几分钟时间内采集到大约24 GB的整个视网膜成像。采用LAS X Navigator软件中焦平面矫正的方法，可以保证视网膜样本每一个位置都处于jia焦平面。

图1：使用THUNDER Imager 3D Cell Culture整个视网膜制片的da化投影图像：A) 宽场原始数据和 B) LVCC结果。插图所示为单个内皮细胞（黄色， CD31抗体）、血管和小胶质细胞（品红色，IsoB4）和星形细胞（青色， GFAP抗体）的宽场视图。图片来源：Jiyeon Lee博士和Jeremy Burton博士，Roche Genentech，美国加利福尼亚州南旧金山。

结论

THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2，3]与传统宽场成像相比，对整个小鼠视网膜成像时会显著增强对比度，可以有效地研究内皮细胞、血管、小胶质细胞和星形细胞间的相互作用。

References：

1.H.J. Junge, S. Yang, J.B. Burton, K. Paes, X. Shu, D.M. French, M. Costa, D.S. Rice, W. Ye, TSPAN12 Regulates Retinal Vascular Development by Promoting Norrin- but Not Wnt-Induced FZD4/β-Catenin Signaling, Cell (2009) vol. 139, iss. 2, pp. 299-311, DOI: 10.1016/j.cell.2009.07.048.

2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.

3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

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