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共聚焦显微镜中的图像是来自一个焦平面的光通过针孔数码相机聚焦拍摄，从而规避来自其支点上方或下方的光。固定在设备上的激光连续聚焦在样品的选定区域，同时，被样品吸附的荧光染料也会被数码相机捕捉。共聚焦设备包含两个旋转镜头用来拍摄组图。
然后通过所累积的不同焦平面的图像序列，使用软件编译完整的3d图像。此图像可以在轴向（z轴）和横向（x和y轴）平面进行微调。这些细胞和其他矩阵的再现是通过使用双倒置的光锥照亮物体来实现的。
使用标准落射荧光显微镜所存在的问题是当遇到较厚的基质或标本时所表现出的荧光程度较大。大于2微米的样品发出的辐射会危及生成图像的准确性，从而损失成像的细节。而共聚焦显微镜则可以通过缩小激发范围并使用光学切片来消除背景噪声。
细胞外基质(ECM)或属于所有细胞的非细胞成分，在细胞功能中是不可少的。ECM的弹性调节细胞的许多生物学功能，例如间充质干细胞的分化、粘附和迁移。
细胞生物学中常常通过水凝胶来模拟ECM。共聚焦显微镜的应用主要在于可与聚丙烯酰胺凝胶的压痕法结合使用。共聚焦自动图像成像可以有效测量ECM模拟中的压痕和穿孔。比如，共聚焦激光显微镜可以测量出PAAM凝胶组合物的深度和刚度。这种方法可以替代AFM纳米压痕法和微针法。
由于共焦成像可以可靠地探测大多数样品表面下方0-200µm之间的任何位置。然而，重要的是要注意，每个样本都有自己的深度，在该深度处散射、光漂白和噪声太高。据说有些标本应该完全避免使用共聚焦显微镜。
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