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激光共聚焦显微镜是一种分子细胞生物学分析仪器，它使用计算机，激光和图像处理技术从生物样品中获得三维数据。它主要用于观察特定分子和离子的生物细胞结构和生物变化，定量分析和实时定量测定。
激光共聚焦显微镜的点光源用于照亮标本，以在焦平面上形成轮廓分明的小点。该点发出的荧光被物镜收集，并沿着原始照明路径返回到由双向彩色镜组成的分光镜。分束器将荧光直接发送到检测器。
光源和检测器的前面有一个针孔，分别称为照明针孔和探针针孔。两者的几何尺寸是一致的，约100-200 nm；两者相对于焦平面上的点是共轭的，即该点穿过一系列透镜，可以同时聚焦在照明针孔和探针针孔上。
以此方式，来自焦平面的光可以会聚在检测孔内，而来自焦平面上方或下方的散射光被阻挡在检测孔之外并且不能被成像。激光逐点扫描样品，检测到针孔后的光电倍增管也逐点获取相应斑点的共焦图像，然后将其转换为数字信号并传输到计算机。
聚合到计算机上屏幕进入整个焦平面的清晰共焦图像。每个焦平面图像实际上是标本的光学横截面。该光学横截面始终具有一定的厚度，也称为光学片。由于焦点处的光强度远大于非焦点处的光强度，并且非焦平面光被针孔过滤。
因此共焦系统的景深大约为零，并沿着Z轴可以实现光学层析成像，这是形成的。观察样品聚焦点的二维光学截面。X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累积连续水平的二维图像并通过特殊的计算机软件进行处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和源针孔总是聚焦在同一点上，因此聚焦面外的激发荧光不能进入检测针孔。激光共聚焦显微镜的工作原理简单地表达为基于激光的光源的系统，该系统基于传统的荧光显微镜成像，具有激光扫描装置和共轭聚焦装置，并通过计算机控制进行数字图像采集和处理。
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